走近西湖大學陶亮團隊：探索疾病潛在療法新策略

諾氏梭狀芽胞桿菌（C. novyi）是一種形成孢子的厭氧細菌和機會性病原體，可在人和動物中引起嚴重的傳染病，包括氣性壞疽，肌炎，壞死性肝炎和敗血癥。 α毒素（Tcnα）是諾氏梭狀芽胞桿菌的主要毒力因子，由所有已知的致病性諾維梭菌產(chǎn)生。但是，Tcnα的宿主受體尚不清楚。

2021年5月10日，西湖大學陶亮團隊在Cell Research 在線發(fā)表題為“Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor mediate the cellular entry of Clostridium novyi alpha-toxin”的研究論文，該研究通過CRISPR / Cas9介導的KO篩選確定了硫酸化的糖胺聚糖是Tcnα的關鍵附著因子。 硫酸糖胺聚糖普遍存在于細胞表面，因此可作為各種傳染原（包括引起全球大流行的新興病毒SARS-COV-2）的理想著陸點。

該研究進一步揭示了硫酸糖胺聚糖與LDLR家族成員之間的協(xié)同作用有助于Tcnα的進入。 最后，該研究證明了硫酸化的糖胺聚糖是體內(nèi)Tcnα引起的肌病的關鍵附著因子，SCD在小鼠模型中有效減少了由Tcnα引起的組織損傷。 這些發(fā)現(xiàn)表明，阻斷Tcnα和硫酸化的糖胺聚糖之間的相互作用可能是開發(fā)針對Tcnα誘導的疾病的潛在療法的新策略。

諾氏梭狀芽胞桿菌（C. novyi）是一種形成孢子的厭氧細菌和機會性病原體，可在人和動物中引起嚴重的傳染病，包括氣性壞疽，肌炎，壞死性肝炎和敗血癥。α毒素（Tcnα）是諾氏梭狀芽胞桿菌的主要毒力因子，由所有已知的致病性諾維梭菌產(chǎn)生。

Tcnα屬于大型梭菌毒素（LCT）家族，其中還包括艱難梭菌毒素A（TcdA），毒素B（TcdB），索氏青枯菌致死性毒素（TcsL），出血性毒素（TcsH）以及產(chǎn)氣莢膜梭菌大細胞毒素（TpeL）。像其他LCT一樣，Tcnα結合到靶細胞的表面，并通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞。然后將酶促結構域遞送到細胞質(zhì)中，并使用UDP-N-乙酰氨基葡糖作為共底物將小Rho家族的GTPases，從而導致細胞骨架破壞和細胞死亡。最近，包括TpeL，TcdB，TcdA和TcsL在內(nèi)的幾種LCT的細胞受體已被鑒定。Tcnα和TcsH是LCT家族中僅有的兩個主要成員，其宿主受體尚不清楚。

為了鑒定Tcnα的潛在受體，該研究進行了全基因組CRISPR / Cas9介導的敲除（KO）篩選。用慢病毒單向?qū)NA（sgRNA）文庫（GeCKO v2）轉(zhuǎn)導穩(wěn)定表達Cas9的HeLa細胞，并用Tcnα進行三輪選擇 。來自存活細胞的sgRNA的下一代測序表明，排名最高的五個富集基因中的四個（包括B4GALT7，B3GALT6，EXT1和SLC35B2）編碼參與硫酸乙酰肝素生物合成的酶。硫酸乙酰肝素生物合成途徑中的其他幾種編碼酶的基因，例如B3GAT3，EXT2，HS6ST3和EXTL3，也在篩選中大大豐富（> 10倍）。

為了驗證硫酸乙酰肝素在Tcnα細胞結合/進入中的作用，該研究通過CRISPR / Cas9生成了 EXT1 ? / ?，EXT2 ? / ?，EXTL3 ? / ?，B4GALT7 ? / ?和SLC35B2 ? / ? HeLa細胞。與WT細胞相比，所有這些KO細胞均表現(xiàn)出對Tcnα的增加的抗性。硫酸乙酰肝素通常以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的形式錨定在核心蛋白上，并且在各種細胞類型中含量豐富，因此可以作為Tcnα的通用細胞表面附著因子。該研究用熒光染料若丹明標記了Tcnα，然后檢查了它與HeLa細胞的表面結合。正如預期的那樣，與WT細胞相比，EXT1?/? 和SLC35B2?/?  HeLa細胞均顯示Tcnα的表面結合大大降低。

在以上測試的KO細胞中，B4GALT7?/?和SLC35B2?/? HeLa 細胞表現(xiàn)出對Tcnα的特別高的抵抗力（> 30倍）。與僅催化硫酸乙酰肝素生物合成的EXT1，EXT2和EXTL3不同，B4GALT7和SLC35B2參與了各種硫酸化聚糖的生物合成。B4GALT7催化糖胺聚糖側鏈合成的啟動，SLC35B2將硫酸鹽供體腺苷3'-磷酸-5'-磷酸硫酸鹽（PAPS）從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)運到高爾基體。為了檢查Tcnα是否也可以識別其他硫酸化的糖胺聚糖，該研究使用與硫酸乙酰肝素結構相關的一組聚糖進行了競爭測定。Tcnα與硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，肝素，硫酸葡聚糖和硫酸化α-環(huán)糊精（SCD）的預孵育均降低了細胞的圓化水平，而透明質(zhì)酸（非硫酸化糖胺聚糖）則沒有抑制作用。一致地，用中和硫酸化糖胺聚糖負電荷的小分子surfen對細胞進行預處理，可以保護HeLa細胞免受Tcnα的侵害。這些結果表明，Tcnα可以識別硫酸化的聚糖，而帶負電荷的硫酸化基團對于相互作用至關重要。

總之，該研究通過CRISPR / Cas9介導的KO篩選確定了硫酸化的糖胺聚糖是Tcnα的關鍵附著因子。硫酸糖胺聚糖普遍存在于細胞表面，因此可作為各種傳染原（包括引起全球大流行的新興病毒SARS-COV-2）的理想著陸點。該研究進一步揭示了硫酸糖胺聚糖與LDLR家族 成員之間的協(xié)同作用有助于Tcnα的進入。最后，該研究證明了硫酸化的糖胺聚糖是體內(nèi)Tcnα引起的肌病的關鍵附著因子，SCD在小鼠模型中有效減少了由Tcnα引起的組織損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明，阻斷Tcnα和硫酸化的糖胺聚糖之間的相互作用可能是開發(fā)針對Tcnα誘導的疾病的潛在療法的新策略。

參考消息：
https://www.nature.com/articles/s41422-021-00510-z

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